Dovitinib (TKI-258)

Dovitinib (TKI-258) inibisce potentemente la crescita stimolata da FGF delle cellule B9 che esprimono WT e F384L-FGFR3 con IC50 di 25 nM. Inoltre, inibisce la proliferazione delle cellule B9 che esprimono ciascuna delle diverse mutanti attivate di FGFR3. È interessante notare che si osservano differenze minime nella sensibilità delle diverse mutazioni di FGFR3 a questo composto, con l'IC50 che varia da 70 a 90 nM per ciascuna delle diverse mutazioni. Le cellule B9 dipendenti dall'IL-6 contenenti solo il vettore (cellule B9-MINV) sono resistenti alla sua attività inibitoria a concentrazioni fino a 1 µM. Inibisce la proliferazione cellulare delle cellule KMS11 (FGFR3-Y373C), OPM2 (FGFR3-K650E) e KMS18 (FGFR3-G384D) con IC50 di 90 nM (KMS11 e OPM2) e 550 nM, rispettivamente. Il composto inibisce la fosforilazione di ERK1/2 mediata da FGF e induce citotossicità nelle cellule MM primarie che esprimono FGFR3. I BMSC conferiscono un modesto grado di resistenza con un'inibizione della crescita del 44,6% per le cellule trattate con 500 nM di Dovitinib e coltivate su stroma rispetto a un'inibizione della crescita del 71,6% per le cellule cresciute senza BMSC. Inibisce la proliferazione di M-NFS-60, una linea cellulare mieloblastica murina guidata dalla crescita di M-CSF con una concentrazione efficace mediana (EC50) di 220 nM. [1] Il trattamento delle cellule SK-HEP1 con questo composto si traduce in una riduzione dose-dipendente del numero di cellule e un arresto in fase G2/M con riduzione delle fasi G0/G1 e S, inibizione della crescita indipendente dall'ancoraggio e blocco della motilità cellulare indotta da bFGF. L'IC50 per questo composto nelle cellule SK-HEP1 è di circa 1,7 µM. Riduce anche significativamente i livelli basali di fosforilazione di FGFR-1, del substrato 2α di FGFR (FRS2-α) e di ERK1/2 ma non di Akt sia nelle cellule SK-HEP1 che nelle 21-0208. Nelle cellule HCC 21-0208, inibisce significativamente la fosforilazione indotta da bFGF di FGFR-1, FRS2-α, ERK1/2 ma non di Akt. [2]

Dovitinib (TKI-258) induce risposte sia citostatiche che citotossiche in vivo, con conseguente regressione dei tumori che esprimono FGFR3.[1] Mostra un'inibizione dose- e esposizione-dipendente dei recettori tirosin chinasici (RTK) bersaglio espressi negli xenotrapianti tumorali. Questo composto inibisce potentemente la crescita tumorale di sei linee di HCC. L'inibizione dell'Angiogenesis è correlata all'inattivazione delle vie di segnalazione FGFR/PDGFRβ/VEGFR2. In un modello ortotopico, inibisce potentemente la crescita tumorale primaria e le metastasi polmonari e prolunga significativamente la sopravvivenza dei topi. [2] La somministrazione di Dovitinib si traduce in una significativa inibizione della crescita tumorale e regressioni tumorali, compresi tumori grandi e consolidati (500-1.000 mm³). [3]

• Saggi chinasici in vitro

  I valori della concentrazione inibitoria del 50% (IC50) per l'inibizione delle RTK da parte di Dovitinib (TKI-258) sono determinati in un formato di fluorescenza risolta nel tempo (TRF) o radioattivo, misurando la sua inibizione del trasferimento di fosfato a un substrato da parte del rispettivo enzima. I domini chinasici di FGFR3, FGFR1, PDGFRβ e VEGFR1-3 sono saggiati in 50 mM HEPES (acido N-2-idrossietilpiperazina-N′-2-etansolfonico), pH 7,0, 2 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂, 1 mM NaF, 1 mM ditiotreitolo (DTT), 1 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA), 0,25 μM di substrato peptidico biotinilato (GGGGQDGKDYIVLPI) e da 1 a 30 μM di adenosina trifosfato (ATP) a seconda del K_m per il rispettivo enzima. Le concentrazioni di ATP sono a o appena al di sotto del K_m. Per le reazioni di c-KIT e FLT3 il pH viene aumentato a 7,5 con 0,2-8 μM di ATP in presenza di 0,25-1 μM di substrato peptidico biotinilato (GGLFDDPSYVNVQNL). Le reazioni sono incubate a temperatura ambiente per 1-4 ore e il peptide fosforilato viene catturato su piastre microtiter rivestite di streptavidina contenenti tampone di blocco della reazione (25 mM EDTA [acido etilendiamminotetraacetico], 50 mM HEPES, pH 7,5). Il peptide fosforilato viene misurato con il sistema DELFIA TRF utilizzando un anticorpo anti-fosfotirosina PT66 marcato con Europio. La concentrazione di questo composto per l'IC50 è calcolata utilizzando la regressione non lineare con il software di analisi dati XL-Fit versione 4.1 (IDBS). L'inibizione dell'attività chinasica del recettore del fattore stimolante le colonie-1 (CSF-1R), PDGFRα, recettore dell'insulina (InsR) e recettore del fattore di crescita insulino-simile 1 (IGFR1) è determinata a concentrazioni di ATP vicine al K_m per l'ATP.

• Linee cellulari

  B9 cells, MM cell lines

• Concentrazioni

  100 nM

• Tempo di incubazione

  48-96 hours

• Metodo

  Cell viability is assessed by 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyl tetrazolium (MTT) dye absorbance. Cells are seeded in 96-well plates at a density of 5 × 10³ (B9 cells) or 2 × 10⁴ (MM cell lines) cells per well. Cells are incubated with 30 ng/mL aFGF and 100 μg/mL heparin or 1% IL-6 where indicated and increasing concentrations of Dovitinib (TKI-258). For each concentration of this compound, 10 μL aliquots of drug or DMSO diluted in culture medium is added. To evaluate its effect on growth of MM cells adherent to BMSCs, 10⁴ KMS11 cells are cultured on BMSC-coated 96-well plates in the presence or absence of it. Plates are incubated for 48 to 96 hours. For assessment of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)-mediated growth, 5 × 10³ M-NFS-60 cells/well are incubated with serial dilutions of it with 10 ng/mL M-CSF and without granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). After 72 hours cell viability is determined using Cell Titer-Glo Assay. Each experimental condition is performed in triplicate.

• Modelli animali

  8-week-old female BNX mice bearing KMS11 cells

• Dosaggi

  10, 30, or 60 mg/kg

• Somministrazione

  Gavage