Belinostat (PXD101)

Le colture subconfluenti vengono raccolte e lavate due volte in PBS ghiacciato e centrifugate a 200 × g per 5 min. Il pellet cellulare viene risospeso in due volumi di tampone di lisi [tampone Tris 60 mM (pH 7.4) contenente 30% di glicerolo e 450 mM NaCl] e lisato mediante tre cicli di congelamento (ghiaccio secco) e scongelamento (bagno d'acqua a 30 °C). I detriti cellulari vengono rimossi mediante centrifugazione a 1.2 × 10⁴ g per 5 min, e il surnatante viene conservato a −80 °C. Il peptide di istone H4 (sequenza SGRGKGGKGLGKGGAKRHRK corrispondente ai 20 residui NH2-terminali) viene acetilato da una proteina ricombinante contenente il dominio ipoxantina-aminopterina-timidina di p300, utilizzando [³H]acetil CoA come fonte di acetato. Il peptide H4 (100 μg) viene miscelato con tampone ipoxantina-aminopterina-timidina (50 mM Tris HCl pH 8.0, 5% glicerolo, 50 mM KCl e 0.1 mM EDTA), 1 mM DTT, 1 mM 4-(2-aminoetil)benzensolfonilfluoruro, 1 × inibitori completi delle proteasi, 50 μL di p300 purificata e 1.85 m [³H]acetil CoA (4.50Ci/mmol) in un volume finale di 300 μL e incubato a 30 °C per 45 min. La proteina p300 viene rimossa mediante incubazione con 20 μL di perle di Ni-agaroasi al 50% per 1 ora a 4 °C e centrifugazione. Il surnatante viene applicato a una colonna Sephadex G15 da 2 mL, e il flusso attraverso viene raccolto. Un millilitro di H₂O distillata viene applicato delicatamente, e vengono raccolte tre frazioni di gocce; questo viene ripetuto fino a quando sono stati aggiunti 4–5 mL di H₂O distillata, e vengono raccolte ~40 frazioni. Tre microlitri di ciascuna frazione vengono diluiti in 2 mL di liquido di scintillazione e contati in un contatore a scintillazione per identificare le frazioni contenenti il peptide marcato. Queste frazioni vengono raggruppate, e 1 μL del campione combinato viene misurato per valutare la radioattività in ogni lotto di peptide (3-7×10³ cpm/μL). Per i saggi di attività, la reazione viene condotta in un volume totale di 150 μL di tampone [60 mM Tris (pH 7.4) contenente 30% di glicerolo] contenente 2 μL di estratto cellulare e, quando utilizzato, 2 μL di questo composto. La reazione viene avviata con l'aggiunta di 2 μL di substrato marcato con [³H] (peptide di istone H4 acetilato corrispondente ai 20 residui NH₂-terminali). I campioni vengono incubati a 37 °C per 45 min, e la reazione viene interrotta con l'aggiunta di HCl e acido acetico (concentrazioni finali rispettivamente di 0.72 e 0.12 M). L'acetato [³H] rilasciato viene estratto in 750 μL di acetato di etile, e i campioni vengono centrifugati a 1.2 × 10⁴ g per 5 min. La fase superiore (600 μL) viene trasferita a 3 mL di liquido di scintillazione e contata.

A2780, A2780/cp70, 2780AD, HCT116, HT29, WIL, CALU-3, MCF7, PC3 and HS852

0.016 - 10 μM

24 hours

Tumor cell lines are seeded in 5 mL of medium at a density of 8 × 10⁴ cells/25 cm2 flask and incubated for 48 hours. Cells are exposed to Belinostat (0.016 to 10 μM) for 24 hours. The medium is removed, and 1 mL of trypsin/EDTA is added to each flask. Once the cells have detached, 1 mL of medium is added, the cells are resuspended, and those from the control untreated flask are counted. Cells are diluted and plated into 6-cm Petri dishes (three per flask) at a density of 0.5-2× 10³ cells/dish depending on the cell line. Cells from the drug-treated flasks are diluted and plated as for the control flasks. Dishes are incubated for 10–15 days at 37 °C. Cells are washed with PBS, fixed in methanol, and stained with crystal violet, and colonies that contained ≥50 cells counted. Sensitivity is expressed as the IC50 defined as the concentration of this compound required to reduce the number of colonies to 50% of that of the control untreated cells.

A2780, A2780/cp70 and HCT116 cells are injected s.c. into the right flank of CD1 nu/nu mice.

≤40 mg/kg

Administered via i.p.