Avasimibe

Avasimibe, alla concentrazione di 1 μg/mL, provoca una riduzione del colesterolo totale (TC) e del colesterolo esterificato (EC) inibendo il legame LDL e diminuendo il numero di recettori scavenger durante la formazione delle cellule schiumose nei macrofagi derivati da monociti umani (HMMs). Questo composto, alla concentrazione di 2 μg/mL, migliora l'efflusso di colesterolo dalle cellule schiumose HMM stabilite preincubate con 10 μg/ml di LDL. [1] Inibisce l'accumulo di Lipoproteina(a) nel terreno di coltura di epatociti primari di scimmia in modo dose-dipendente con un'inibizione dell'11,9% -31,3%, il cambiamento è principalmente associato alla diminuzione di ApoA. [2] Questo composto chimico, incubato a concentrazioni di 10 nM, 1 μM e 10 μM per 24 ore in cellule HepG2, riduce la secrezione di ApoB nel mezzo del 25%, 27% e 43%, rispettivamente. Diminuisce la secrezione di ApoB tramite una degradazione intracellulare potenziata di ApoB piuttosto che una sintesi diminuita di ApoB. [3] Il composto inibisce ACTC con un IC50 di 3,3 μM in macrofagi IC-21 considerando la concentrazione totale dell'inibitore nel campione del saggio. [4] Inibisce gli isoenzimi umani P450 CYP2C9, CYP1A2 e CYP2C19 con un IC50 di 2,9 μM, 13,9 μM e 26,5 μM, rispettivamente. [5] Questo inibitore inibisce l'espressione di ACAT-1 e la sintesi di esteri del colesterolo nelle linee cellulari di glioma. Inibisce la crescita delle cellule di glioma inducendo l'arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi dovuta all'attivazione della caspasi-8 e della caspasi-3. [6]

Avasimibe riduce significativamente i livelli di Lipoproteina(a) e di colesterolo totale in nove scimmie maschi sani con una dieta normale, trattate oralmente con CI-1011 a 30 mg/kg al giorno per 3 settimane; i livelli di Lipoproteina(a) e di colesterolo totale si riducono rispettivamente al 68% e al 73% dei livelli di controllo. Questo composto diminuisce il colesterolo totale principalmente a causa della riduzione delle lipoproteine a bassa densità (LDL). [2] Diminuisce il carico di placche amiloidi nella corteccia e nell'ippocampo e riduce i livelli di Abeta40 e Abeta42 insolubili e dei frammenti C-terminali della proteina precursore dell'amiloide (APP) negli estratti cerebrali in giovani topi transgenici umani APP. Questa sostanza chimica riduce le placche amiloidi diffuse attraverso la soppressione dell'astrogliosi e l'attivazione microgliale potenziata in topi transgenici umani APP anziani. [7]

• Studi di inibizione del P450

  Microsomi epatici umani (HLM) raggruppati da almeno 15 donatori sono utilizzati per tutti i saggi di inibizione. Per le determinazioni dell'IC50, le sonde substrato sono utilizzate ai loro valori di Km in vitro approssimativi. Tutte le incubazioni sono eseguite con 100 mM di tampone di fosfato di potassio (pH 7,4) e 1 mM di NADPH. Per lo studio di inibizione del CYP1A2, le incubazioni sono eseguite in un volume totale di 0,5 ml, in duplicato con 0,1 mg/ml di HLM, 30 μM di fenacetina, 1 mM di NADPH e in presenza di questo composto (0, 0,3, 0,75, 1,5, 3, 7,5, 15, 30 e 40 μM in 50 mM) in un tampone di fosfato di potassio a pH 7,4. Dopo preincubazione a 37 °C per 7 min, viene aggiunto NADPH per avviare la reazione enzimatica. La miscela di reazione viene spenta con 500 μl di paracetamolo-D₄/CH₃CN ghiacciato a 100 ng/ml dopo 25 min. Gli standard (4-acetamidofenolo, singoletto) e i controlli di qualità (triplicati per basso, medio e alto) sono preparati a temperatura ambiente. Dopo la miscelazione, 0,2 ml dei campioni vengono trasferiti in un'altra piastra e sottoposti ad analisi LC/MS/MS dopo centrifugazione a 3000 rpm per 10 min. Viene utilizzata una colonna Supelco Discovery Amide C16, 100 × 2,1 mm (dimensione delle particelle di 5 μm) (Supelco, Bellefonte, PA). La fase mobile è isocratica, 40:60 [acetonitrile/acido formico, 0,1% (v/v)] a 0,2 ml/min.

• Linee cellulari

  primary human monocyte-derived macrophages

• Concentrazioni

  1 μg/mL or 2 μg/mL

• Tempo di incubazione

  48 hours

• Metodo

  For foam cell formation, the growth medium (RPMI medium containing 10% human serum) is aspirated and the BMMs are rinsed four times with RPMI medium, and then HMMs are exposed to RPMI medium containing bovine serum albumin (BSA, 0.2%) and (DMSO, 0.2%, vehicle for CI-1011) (control medium) with and without agacLDL (100 μg protein/ml) and this compound (1 μg/ml) for 48 hours. For cholesterol efflux experiments, HMMs are preincubated with ag-acLDL (100 μg protein/ml) for 24h, and then exposed to control RPMI medium with and without HDL (100 μg protein/ml), this compound (2 μg/ml) or HDL plus this compound (2 μg/ml) for 24–48 hours. Additionally, the appearance of [¹⁴C]FC in the medium is monitored by first preincubating HMMs with RPMI medium containing ag-acLDL (100 μg protein/ml) radiolabeled with [4-¹⁴C]FC (0.5 μCi/ml) in an ethanolic spritz (final concentration, 0.1%) for 24 h. The medium is removed, cells rinsed three times with RPMI medium, and then cells are exposed to control RPMI medium with and without this compound (1–10 μg/ml) for 4–48 h. At each time point, the medium is aspirated and centrifuged to pellet nonadherent cells. The appearance of [¹⁴C]FC in the medium is measured by liquid scintillation spectroscopy. Cellular lipids are extracted using hexane:isopropanol (3:2, v/v) for 1 h. The distribution of cellular radiolabeled cholesterol is measured by subjecting an aliquot of the cell extract and FC and EC standards to thin layer chromatography using petroleum ether:hexane:glacial acetic acid solvent system (85:15:2, v/v). The percent FC efflux is calculated as: medium [¹⁴C]FC dpm/ cell [¹⁴C] dpm×100. FC and TC mass are quantified by gas liquid chromatography using stigmasterol (1 mg/ml) as an internal standard. EC mass is calculated as the difference between TC and FC, and all values are normalized to cell protein. The MBC is defined as the lowest concentration that exhibited 99.9% or more reduction of the numbers of colonies compared with the cfu in the initial inoculum.

• Modelli animali

  male cynomolgus monkeys

• Dosaggi

  30 mg/kg

• Somministrazione

  Orally at a single dose per day for 3 weeks