Apatinib (YN968D1) mesylate

Apatinib (YN968D1) è un nuovo inibitore selettivo, biodisponibile per via orale, con potenziali attività antiangiogeniche e antineoplastiche. Apatinib si lega selettivamente e inibisce VEGFR2. Apatinib può anche sopprimere potentemente le attività di Ret, c-kit e c-src con IC50 di 0,013 μM, 0,429 μM e 0,53 μM, rispettivamente. Apatinib inibisce la fosforilazione cellulare di VEGFR-2, c-kit e PDGFRβ. Apatinib inibisce significativamente la proliferazione stimolata da 20 ng/mL di VEGF (IC50 = 0,17μM). Apatinib inibisce efficacemente la proliferazione, la migrazione e la formazione di tubi delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana indotte da FBS e ha bloccato la germinazione dell'anello aortico di ratto. [1] Apatinib inverte la MDR mediata da ABCB1 e ABCG2 inibendo la loro funzione di trasporto, ma non bloccando la via AKT o ERK1/2 o down-regolando l'espressione di ABCB1 o ABCG2. Apatinib potenzia significativamente la citotossicità dei substrati ABCB1 e ABCG2 stabiliti e ha aumentato l'accumulo di DOX e Rho 123 nelle cellule che sovraesprimono ABCB1 o ABCG2. Inoltre, apatinib ha inibito significativamente l'etichettatura per fotoaffinità sia di ABCB1 che di ABCG2 con [¹²⁵I]iodoarilazidoprazosin in modo concentrazione-dipendente. [2]

Apatinib inibisce la crescita di un'ampia gamma di xenotrapianti tumorali umani in modo significativo e dose-dipendente. [1] Apatinib inverte la MDR mediata da ABCB1 nel modello di xenotrapianto di topo nudo. [2] Apatinib migliora significativamente l'attività antitumorale della doxorubicina in topi nudi portatori di xenotrapianti K562/ADR. [3]

• Saggio immunoassorbente legato all'enzima (ELISA)

  Come soluzione di substrato contenente tirosina viene utilizzato un copolimero casuale di poli(glu, ala, tyr) 6:3:1. Il substrato viene conservato come stock di 1 mg/mL in PBS a –20 °C e diluito 1:500 con PBS al fine di rivestire piastre a 96 pozzetti (100 μL/pozzetto). Le piastre vengono rivestite il giorno precedente il saggio, sigillate con sigilli adesivi e conservate durante la notte a 4 °C. Il giorno del saggio, la soluzione di substrato viene scartata e i pozzetti della piastra di saggio vengono lavati una volta con PBST (PBS contenente 0,05% v/v di Tween 20) e una volta con tampone Hepes (50 mM, pH 7,4). I composti di prova vengono diluiti con acqua deionizzata al 10% di DMSO e 25 μL di volumi vengono trasferiti nei pozzetti delle piastre di saggio lavate. La soluzione di cloruro di manganese (40 mM) contenente 8 μM di ATP viene quindi aggiunta (25 μL) a tutti i pozzetti di prova. Vengono inclusi anche pozzetti di controllo e in bianco, contenenti diluente del composto e soluzione di cloruro di manganese con e senza ATP, rispettivamente, per determinare l'intervallo dinamico del saggio. L'enzima appena diluito (50 μL) viene aggiunto a ciascun pozzetto e le piastre vengono incubate a temperatura ambiente per 20 min. Il liquido viene quindi scartato e i pozzetti vengono lavati due volte con PBST. L'anticorpo IgG anti-fosfotirosina di topo diluito 1:6000 con PBST contenente 0,5% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) viene aggiunto (100 μL/pozzetto) e le piastre vengono incubate per 1h a temperatura ambiente prima di scartare il liquido e lavare i pozzetti due volte con PBST. L'anticorpo Ig anti-topo di pecora legato alla perossidasi di rafano (HRP) diluito 1:500 con PBST contenente 0,5% (p/v) di BSA, viene quindi aggiunto (100 μL/pozzetto) e le piastre vengono incubate per un'ulteriore 1 h a temperatura ambiente prima di scartare il liquido e lavare i pozzetti due volte con PBST. Una soluzione di 1 mg/mL di acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-solfonico viene preparata fresca in tampone fosfato-citrato 50 mM (pH 5,0) contenente 0,03% (p/v) di perborato di sodio e vengono aggiunti 100 μL a ciascun pozzetto. Le piastre vengono quindi incubate per 20-60 min a temperatura ambiente fino a quando il valore di densità ottica dei pozzetti di controllo misurato a 405 nm non è approssimativamente 1,0. I valori di IC50 per l'inibizione enzimatica del composto vengono interpolati utilizzando Microcal Origin dopo la sottrazione dei valori in bianco.

• Linee cellulari

  HUVEC

• Concentrazioni

  ~25 μM

• Tempo di incubazione

  72 h

• Metodo

  The HUVEC are seeded into 96-well plates. After 24 h of incubation, cells are exposed to the test agents (vehicle as control) together with 20 ng/mL VEGF or 20% FBS for another 72 h. After fixation with 10% trichloroacetic acid, the cells are stained with 0.4% sulforhodamine B for 30 min at 37 °C and then washed with 1% acetic acid. Tris is added to dissolve the complex, and the optical density is measured at 520 n

• Modelli animali

  Ls174t, HCT 116, SGC-7901, HT-29, A549, NCI-H460 xenografted BALB/cA nude mice

• Dosaggi

  50, 100, 200 mg/kg

• Somministrazione

  p.o.