AG-14361

AG14361 è almeno 1000 volte più potente dei benzammidi. L'IC50 per AG14361 è di 29 nM nelle cellule SW620 permeabilizzate e di 14 nM nelle cellule SW620 intatte. L'analisi cristallografica di AG14361 legato al dominio catalitico della PARP-1 di pollo mostra che il sistema ad anello triciclico di AG14361 si trova in una tasca composta dai residui amminoacidici Trp861, His862, Gly863, Tyr896, Phe897, Ala898, Lys903, Ser904, Tyr907 e Glu988. AG14361 forma importanti legami idrogeno con Ser904 e Gly863 e un legame idrogeno mediato dall'acqua con Glu988. L'inibizione della crescita indotta da AG14361 non è attribuita a effetti correlati alla PARP-1 perché la massima inibizione della PARP-1 si osserva a concentrazioni molto più basse (≤1 μM) rispetto al GI50. AG14361 a 0,4 μM non influenza l'espressione genica o la crescita delle cellule tumorali, ma aumenta l'attività antiproliferativa e inibisce il recupero dai danni da radiazioni γ potenzialmente letali nelle cellule LoVo del 73%. Inoltre, 0,4 μM AG14361 non altera sostanzialmente l'espressione genica come mostrato dall'analisi di microarray. Un'esposizione di 17 ore di cellule A549 a 0,4 μM AG14361 non cambia l'espressione dei 6800 geni. Quindi, sebbene 0,4 μM AG14361 inibisca l'attività cellulare della PARP-1 di oltre l'85%, non cambia essenzialmente l'espressione genica e la proliferazione cellulare, indicando che gli effetti cellulari di questa bassa concentrazione di AG14361 sono specifici per l'inibizione della PARP-1. Concentrazioni più elevate, che inibiscono la crescita, di AG14361 influenzano l'espressione genica, ma è improbabile che questi effetti siano correlati all'inibizione della PARP-1 perché la proliferazione cellulare è influenzata in modo uguale nelle cellule PARP^-/^- e PARP-1⁺/⁺. AG14361 viene rapidamente assorbito nel flusso sanguigno e distribuito al tumore e al fegato con concentrazioni più basse rilevate nel cervello. Il rapporto di concentrazione tessuto-plasma indica che AG14361 viene trattenuto nel tessuto tumorale nel tempo in entrambi i modelli di xenotrapianto, con concentrazioni tumorali (≥15 μM per 2 ore) in eccesso rispetto a quelle richieste per inibire l'attività della PARP-1 in vitro. [1] AG14361 potenzia l'attività in tutte le cellule MMR-competenti (1,5–3,3 volte) ma è più efficace nelle cellule MMR-deficienti (potenziamento di 3,7–5,2 volte), superando la resistenza. Al contrario, la benzilguanina aumenta l'efficacia solo nelle cellule MMR-competenti ma è inefficace nelle cellule MMR-deficienti. [2] AG14361 potenzia gli effetti inibitori della crescita e citotossici dei veleni della topoisomerasi I. AG14361 aumenta la persistenza delle rotture del singolo filamento di DNA indotte dalla camptotecina. [3]

Il trattamento con AG14361 prima dell'irradiazione aumenta in modo statisticamente significativo la sensibilità alla radioterapia di topi portatori di xenotrapianti LoVo. AG14361 aumenta in modo statisticamente significativo il flusso sanguigno negli xenotrapianti e, quindi, potenzialmente aumenta la somministrazione di farmaci ai xenotrapianti tumorali. In vivo, dosi non tossiche di AG14361 aumentano il ritardo della crescita degli xenotrapianti LoVo indotto dalla raggi X di 2-3 volte. La co-somministrazione di AG14361 aumenta in modo statisticamente significativo l'attività contro gli xenotrapianti LoVo, con il ritardo della crescita tumorale che aumenta da 3 giorni a 9 giorni con AG14361 a 5 mg/kg e a 10 giorni con AG14361 a 15 mg/kg. La combinazione di AG14361 causa una regressione completa dei tumori xenotrapiantati SW620. L'attività della PARP-1, rilevata mediante saggio farmacodinamico, negli xenotrapianti SW620 è inibita di oltre il 75% per almeno 4 ore dopo la somministrazione intraperitoneale di AG14361 (10 mg/kg), coerentemente con la concentrazione di AG14361 che persiste nel tumore. [1]

• Saggi di attività della PARP-1

  L'attività della PARP-1 umana ricombinante a lunghezza intera viene misurata in una miscela di reazione contenente 20 nM PARP-1, 500 μM NAD⁺ più [³²P]NAD⁺ (0,1–0,3 μCi per miscela di reazione) e DNA di timo di vitello attivato (10 μg/mL) a 25^oC; la reazione viene terminata dopo 4 minuti aggiungendo acido tricloroacetico al 10% (p/v) ghiacciato. Il prodotto di reazione [³²P]ADP-ribosio incorporato nel materiale insolubile in acido viene depositato su filtri in fibra di vetro Whatman GF/C con un apparecchio di microfiltrazione Bio-Dot e quantificato con un PhosphorImager. Viene misurata l'inibizione dell'attività della PARP-1 da parte di AG14361 a 0–600 nM e il K_i per AG14361 viene calcolato mediante analisi di regressione non lineare.

• Linee cellulari

  LoVo and SW620 colorectal cancer cells and A549 non–small-cell lung carcinoma cells.

• Concentrazioni

  0-20 μM

• Tempo di incubazione

  5 days

• Metodo

  LoVo and SW620 colorectal cancer cells and A549 non–small-cell lung carcinoma cells are maintained in RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum. Cell growth inhibition is estimated in exponentially growing LoVo, A549, and SW620 cells in 96-well plates. Cells are exposed to AG14361 (0–20 μM) alone. After 5 days of culture, these cells are fixed with 10% trichloroacetic acid and stained with sulforhodamine B. The concentration of  AG14361 alone or in combination that inhibits growth by 50% (GI50) is calculated from computer-generated curves. Recovery from potentially lethal damage is measured in confluent LoVo cell cultures arrested in G1 phase to mimic the radiation-resistant quiescent cell population in tumors. Such cells are exposed to 8 Gy of γ-irradiation and then harvested and plated for colony formation assay immediately or maintained as growth-arrested confluent cultures for a 4-hour or 24-hour recovery period before harvesting and plating for the colony formation assay. Where indicated, 0.4 μM AG14361 is added 30 minutes before irradiation and is present in the recovery incubation.

• Modelli animali

  SW620 or LoVo xenografts in CD-1 nude mice

• Dosaggi

  5 or 15 mg/kg

• Somministrazione

  Treated intraperitoneally, once daily for 5 days