AG-490

AG-490 inibisce la proliferazione cellulare indotta da HER-2 con IC50 di 3,5 μM. [1] Corrispondente alla specifica inibizione dose-dipendente di JAK2 costitutivamente attivato nelle cellule di leucemia acuta pre-B (ALL), questo composto (5 μM) blocca quasi completamente la crescita di tutte le cellule ALL inducendo la morte cellulare programmata, senza effetti deleteri sull'ematopoiesi normale. Questa sostanza chimica non inibisce le attività di Lck, Lyn, Btk, Syk e Src. [2] Esso (60-100 μM) blocca l'attivazione costitutiva di Stat3sm e inibisce la crescita spontanea e quella indotta dall'interleuchina 2 delle cellule tumorali di micosi fungoide (MF) con valori di IC50 rispettivamente di 75 μM e 20 μM. [3] Questo composto inibisce potentemente la crescita delle cellule T umane mediata da IL-2 con un IC50 di 25 μM bloccando le attività di JAK3 e STAT5a/b. [4] Inibisce significativamente l'attivazione costitutiva di Stat3 nelle cellule MOPC, MPC11 e S194, portando a una drammatica apoptosi dose-dipendente. [6] Questa sostanza chimica (100 μM) inibisce la fosforilazione di Akt, inibisce l'attivazione del fattore nucleare-κB e causa l'attivazione di GSK-3β, portando alla riduzione di c-Myc. Essa (50 μM) può indurre l'apoptosi delle cellule BaF3 che esprimono i mutanti T315I ed E255K di Bcr-Abl. [7] Questo composto a 30 μM inibisce non solo la fosforilazione di JAK2 wild-type indotta da Epo, ma anche la fosforilazione costitutiva del mutante JAK2 V617F. Inibisce anche potentemente la crescita cellulare indipendente dalle citochine indotta dal mutante JAK2 V617F nelle cellule BaF3. [8]

L'amministrazione di AG-490 riduce drasticamente il numero di cellule CD45⁺ e HLA-DR⁺ dal 48 % e 46 % nel midollo osseo di topi non trattati, così come dal 38 % e 22 % nella milza di topi non trattati, a livelli non rilevabili. [2] L'amministrazione in vivo di questo composto causa l'apoptosi delle cellule tumorali di mieloma murino ma non inibisce l'attivazione dei macrofagi mediata da IL-12 e la produzione di IFN-γ da parte dei linfociti. [6] Coerentemente con il blocco in vitro dell'attività del mutante JAK2 V617F, il trattamento con questa sostanza chimica a 0,5 mg/giorno per 10 giorni inibisce efficacemente la tumorigenesi e l'invasione delle cellule tumorali indotte dal mutante JAK2 V617F nei topi nudi. [8] La terapia combinata con questo agente e IL-12 induce effetti antitumorali maggiori rispetto a ciascun agente da solo in un modello murino di tumore di mieloma. [6]

• Autofosforilazione chinasica in vitro

  AG-490 viene disciolto in DMSO 10%-H₂O-etanolo 45%. Estratti di membrana grezzi (0,125 μg/mL) vengono preattivati con EGF (20 nM) in tampone HEPES 50 mM, pH 7,6, e NaCl 125 mM, per 15 minuti a 4 °C. L'attività di autofosforilazione della chinasi EGFR o ErbB2 viene saggiata a 4 °C per 30 secondi in piastre a 96 pozzetti a forma di V. Estratti di membrana (8 μL) vengono aggiunti a ciascun pozzetto contenente la miscela di reazione (12 μL, HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 125 mM, M₈Ac₂ 12 mM, MnCl₂ 2 mM, NaVO₃ 1 mM, ATP 1 μM e 1 μCi [γ-³²P]ATP, concentrazioni finali) e concentrazioni crescenti di questo composto (4 μL). Dopo la terminazione mediante aggiunta di tampone campione caldo, i campioni vengono eseguiti su un minigel di elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS al 6%, i gel vengono essiccati e viene eseguita l'autoradiografia durante il periodo di tempo di esposizione lineare. Le bande del recettore vengono scansionate densitrometricamente e i risultati analizzati dal programma Ez-Fit. Per l'analisi dell'autofosforilazione di JAK2, JAK2 viene immunoprecipitata utilizzando un anticorpo anti-JAK2 da lisati di cellule G2 pretrattate per 16 ore con concentrazioni crescenti di questa sostanza chimica (0-50 μM). I complessi immuni vengono quindi immunoblottati con un anticorpo anti-fosfotirosina. Un'inibizione dose-dipendente dell'attività chinasica in vitro è dimostrata valutando l'autofosforilazione di JAK2.

• Linee cellulari

  Pre-B ALL

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~ 50 μM

• Tempo di incubazione

  16 hours

• Metodo

  Cells are exposed to different concentrations of AG-490 for 16 hours. For the determination of cell proliferation, [³H]tymidine (1 μCi) is added 6 hours or more before the cultures are terminated. Cells are then collected and samples counted in a liquid scintillation counter.

• Modelli animali

  SCID mice intravenously injected with ALL cells

• Dosaggi

  0.85 mg + 0.5 mg daily

• Somministrazione

  Continuous pump infusion supplemented with daily intraperitoneal injections