A-966492

A-966492 è uno degli inibitori di PARP più potenti. Questo composto mostra un'eccellente potenza contro l'enzima PARP-1 con un K_i di 1 nM e un EC50 di 1 nM in un saggio su cellule intere. Migliora significativamente l'efficacia di TMZ in modo dose-dipendente. Inoltre, questa sostanza chimica è biodisponibile per via orale in più specie, attraversa la barriera emato-encefalica e sembra distribuirsi nel tessuto tumorale. Rappresenta un analogo del benzimidazolo promettente e strutturalmente diversificato e viene ulteriormente caratterizzato in fase preclinica. [1]

A-966492 dimostra anche una buona efficacia in vivo in un modello murino di melanoma sottocutaneo B16F10 in combinazione e in un modello di xenotrapianto di cancro al seno MX-1 sia come agente singolo che in combinazione. Inoltre, questo composto ha eccellenti proprietà farmaceutiche e ha dimostrato efficacia in vivo in modelli tumorali murini preclinici in combinazione con TMZ, nonché attività come agente singolo in un modello tumorale MX-1 deficitario di BRCA1. Viene ulteriormente caratterizzato in ratti Sprague-Dawley, cani beagle e scimmie cynomolgus, con questa sostanza chimica che dimostra biodisponibilità orale del 34-72% e emivite di 1,7-1,9 ore. In vivo, dimostra un significativo miglioramento dell'efficacia di TMZ in un modello di melanoma singenico murino B16F10, con i gruppi di combinazione che mostrano un'efficacia superiore. [1]

• Saggio enzimatico PARP

  Il saggio enzimatico viene condotto in un tampone contenente 50 mM Tris, pH 8,0, 1 mM ditiotreitolo (DTT) e 4 mM MgCl₂. Le reazioni PARP contengono 1,5 μM [³H]-NAD⁺ (1,6 μCi/mmol), 200 nM di istone H1 biotinilato, 200 nM di slDNA e 1 nM di enzima PARP-1 o 4 nM di enzima PARP-2. Le auto-reazioni che utilizzano la rilevazione basata su perline SPA vengono eseguite in volumi di 100 μL in piastre a 96 pozzetti bianche. Le reazioni vengono avviate aggiungendo 50 μL di miscela di substrato NAD⁺ 2X a 50 μL di miscela enzimatica 2× contenente PARP e DNA. Queste reazioni vengono terminate con l'aggiunta di 150 μL di 1,5 mM benzamide (circa 1 × 10³ volte il suo IC50). Un volume di 170 μL delle miscele di reazione bloccate viene trasferito su piastre Flash rivestite di streptavidina, incubato per 1 ora e contato utilizzando un contatore a scintillazione per micropiastre TopCount. I dati di K_i sono determinati da curve di inibizione a varie concentrazioni di substrato.

• Linee cellulari

  C41 cell

• Concentrazioni

  ~10 nM

• Tempo di incubazione

  30 minutes

• Metodo

  C41 cells are treated with A-966492 for 30 minutes in a 96-well plate. PARP are activated by damaging DNA with 1 mM H₂O₂ for 10 minutes. Cells are washed with ice-cold phosphate-buffered saline (PBS) once and fixed with prechilled methanol/acetone (7:3) at -20 °C for 10 minutes. After they are air-dried, plates are rehydrated with PBS and blocked using 5% nonfat dry milk in PBS-Tween(0.05%) (blocking solution) for 30 minutes at room temperature. Cells are incubated with anti-PAR antibody 10H (1:50) in blocking solution at room temperature for 60 minutes followed by washing with PBS-Tween20 five times, and incubation with goat antimouse 5(6)-isothiocyanate (FITC)-coupled antibody (1:50) and 1 μg/mL 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in blocking solution at room temperature for 60 minutes. After washing with PBS-Tween20 5 times, analysis is performed using an fmax Fluorescence Microplate Reader set at the excitation and emission wavelength for FITC or the excitation and emission wavelength for DAPI. PARP activity (FITC signal) is normalized with cell numbers (DAPI).

• Modelli animali

  A 0.2 cc amount of a 1:10 dilution of tumor brei in 45% Matrigel and 45% Spinner MEM is injected subcutaneously into the flank of female SCID mice.

• Dosaggi

  12.5, 25, and 50 mg/kg/day, for 14 days

• Somministrazione

  Orally administrated