3-Methyladenine (3-MA)

La leggera preferenza per la prevenzione di Vps34 da parte della 3-Methyladenine (3-MA) deriva probabilmente da un anello idrofobico specifico di Vps34, che circonda il gruppo 3-metile di questo composto. [1] È stato riportato che causa la morte delle cellule tumorali sia in condizioni normali che di fame, e potrebbe anche sopprimere la migrazione e l'invasione cellulare indipendentemente dalla sua capacità di inibire l'Autophagy, implicando che possiede funzioni diverse dalla soppressione dell'Autophagy. Questo composto induce la morte cellulare caspasi-dipendente che è indipendente dall'inibizione dell'Autophagy. Il trattamento con 5 mM di esso riduce la percentuale di cellule HeLa private di glucosio che mostrano punti GFP-LC3 al 23%. I livelli di LC3-I aumentano e i livelli di LC3-II diminuiscono tra 12 e 48 ore nelle cellule trattate con 3-MA. La conversione di LC3-I in LC3-II è soppressa dal composto. Il trattamento delle cellule HeLa con esso a 2,5 mM o 5 mM per un giorno non influisce sulla vitalità cellulare, mentre il trattamento con 10 mM per un giorno provoca una diminuzione del 25,0% della vitalità cellulare. Il trattamento delle cellule con 2,5, 5 o 10 mM per due giorni provoca una diminuzione della vitalità dell'11,5%, 38,0% e 79,4%, rispettivamente. Diminuisce la vitalità cellulare in modo tempo- e dose-dipendente e accorcia significativamente la durata dell'arresto prometasico indotto dal nocodazolo. [2] La soppressione dell'Autophagy da parte della 3-MA inibisce la morte cellulare indotta da SU11274. [3] Il trattamento prolungato con esso (fino a 9 ore) induce una significativa conversione di LC3 I a II nei MEF di tipo selvaggio. Il trattamento prolungato con 3-MA, ma non con wortmannina, aumenta marcatamente la punteggiatura/aggregazione di GFP-LC3. La sua conversione di LC3 indotta e la liberazione di GFP libera sono ATG7-dipendenti. Il trattamento con esso porta a un evidente aumento del livello della proteina p62. Il composto aumenta il livello di p62 anche nei MEF Atg5−/− così come nelle cellule con delezione di ATG5 mediata da DOX. Inibisce la PI3K di classe I e di classe III con schemi temporali diversi. La sua conversione di LC3 I a LC3 II indotta è drasticamente compromessa nelle cellule Tsc2−/− rispetto alle cellule di tipo selvaggio. Questo composto interrompe la funzione anti-autofagica del complesso mTOR 1. [4]

La 3-Methyladenine (3-MA) blocca l'Autophagy attraverso il suo effetto sulla fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) di classe III. Il trattamento con questo composto non altera il grado di emorragia rispetto al gruppo con emorragia subaracnoidea (SAH). Il suo pretrattamento aggrava significativamente i sintomi neurologici se confrontato con il gruppo SAH + veicolo. L'Autophagy è diminuita quando viene applicata. Al contrario, la caspasi-3 clivata è marcatamente sovraregolata nel gruppo SAH + 3-MA. In linea con la sovraregolazione dell'espressione della caspasi-3 clivata, il numero di cellule TUNEL-positive nella corteccia destra è significativamente aumentato nel gruppo SAH + 3-MA rispetto al gruppo SAH + veicolo. [5]

• Saggio di degradazione proteica

  Le cellule HeLa vengono radiomarcate per 24 ore con 0,05 mCi/mL di l-[U- ¹⁴C]valina. Al termine del periodo di marcatura, le cellule vengono risciacquate tre volte con PBS. Le cellule vengono incubate per i tempi designati in terreno completo o EBSS con o senza la presenza di 10 mM di 3-Methyladenine (3-MA).

• Linee cellulari

  HeLa cell line

• Concentrazioni

  1-10 mM

• Tempo di incubazione

  24, 48 or 72 hours

• Metodo

  After treatment with 3-Methyladenine (3-MA), cell (such as HeLa cell) viability is determined by a trypan blue exclusion assay. Briefly, both adherent and floating cells are collected and suspended in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) at a final density of 1-2 × 10⁶/mL. An equal volume of 0.4% trypan blue solution (w/v, in PBS) is added to the cell suspension and mixed thoroughly. After incubation at room temperature for 3 min, cell counting is performed using a hemacytometer.

• Modelli animali

  Adult male Sprague–Dawley rats weighing 300-350 g

• Dosaggi

  400 nM

• Somministrazione

  Intracerebral ventricular