PHA-793887 CDK inhibitor

Multi-CDK inhibitor.

PHA-793887 ha una bassa attività contro CDK1, CDK4, CDK9 e GSK3β con IC50 rispettivamente di 60 nM, 62 nM, 138 nM e 79 nM. Questo composto inibisce la proliferazione cellulare di molte linee cellulari tumorali, tra cui A2780, HCT-116, COLO-205, C-433, DU-145, A375, PC3, MCF-7 e BX-PC3, con IC50 di 88 nM–3,4 μM. Esso (1 μM) mostra una diminuzione nella fase S, un successivo aumento della fase G1 e un leggero accumulo della fase G2/M nelle cellule A2780. Questa sostanza chimica (3 μM) aumenta significativamente la fase G2/M e riduce la sintesi del DNA. [1] È citotossico per le linee cellulari leucemiche, tra cui K562, KU812, KCL22 e TOM1, con IC50 di 0,3–7 μM, ma non è citotossico per le cellule mononucleate del sangue periferico normali non stimolate o per le cellule staminali ematopoietiche CD34+. Nei saggi clonogenici, questo composto mostra un'attività molto elevata contro le linee cellulari leucemiche con IC50 inferiore a 0,1 μM. Induce l'arresto del Cell Cycle, inibisce la fosforilazione di Rb e nucleofosmina, modula l'espressione di ciclina E e cdc6 a 0,2−1 μM e induce Apoptosis related a 5 μM. [2]

Saggio della chinasi CDK

L'attività biochimica dei composti è determinata mediante incubazione con enzimi e substrati specifici, seguita dalla quantificazione del prodotto fosforilato. PHA-793887 (1,5 nM–10 μM) viene incubato per 30-90 min a temperatura ambiente in presenza di una miscela di ATP/³³P-γ-ATP, substrato e l'enzima specifico (0,7-100 nM) in un volume finale di 30 μL di tampone chinasico, utilizzando piastre da 96 pozzetti a fondo a U. Dopo l'incubazione, la reazione viene interrotta e il substrato fosforilato viene separato dall'ATP radioattivo non incorporato utilizzando biglie SPA, resina Dowex o un filtro in fosfocellulosa Multiscreen come segue: (1) Per i saggi SPA. La reazione viene interrotta mediante l'aggiunta di 100 μL di PBS + 32 mM EDTA + 0,1% Triton X-100 + 500 μM ATP, contenente 1 mg di biglie SPA rivestite di streptavidina. Dopo 20 min di incubazione per la cattura del substrato, 100 μL della miscela di reazione vengono trasferiti in piastre Optiplate da 96 pozzetti contenenti 100 μL di CsCl 5 M, lasciati riposare per 4 ore per consentire la stratificazione delle biglie sulla parte superiore della piastra e contati utilizzando TopCount per misurare il fosfato incorporato nel substrato. (2) Per il saggio su resina Dowex. Viene aggiunta una quantità di 150 μL di resina/formiato, pH 3,00, per interrompere la reazione e catturare l'³³P-γ-ATP non reagito, separandolo dal substrato fosforilato in soluzione. Dopo 60 min di riposo, 50 μL di supernatante vengono trasferiti in piastre Optiplate da 96 pozzetti. Dopo l'aggiunta di 150 μL di Microscint 40, la radioattività viene contata nel TopCount. (3) Per il saggio Multiscreen. La reazione viene interrotta con l'aggiunta di 10 μL di EDTA (150 mM). Una quantità di 100 μL viene trasferita su una piastra MultiScreen per consentire il legame del substrato al filtro in fosfocellulosa. Le piastre vengono quindi lavate tre volte con 100 μL di H₂PO₄ (75 mM) filtrato tramite un sistema di filtrazione MultiScreen ed essiccate. Dopo l'aggiunta di 100 μL di Microscint 0, la radioattività viene contata nel TopCount. I valori di IC50 sono ottenuti mediante analisi di regressione non lineare.

PHA-793887 (10–30 mg/kg) mostra una buona efficacia nei modelli di xenotrapianto di carcinoma umano ovarico A2780, del colon HCT-116 e pancreatico BX-PC3. [1] Questo composto (20 mg/kg) è efficace nei modelli di xenotrapianto di cellule K562 e HL60, in un modello leucemico disseminato primario e in un modello ALL-2 disseminato ad alto carico derivato da un paziente con leucemia linfoblastica acuta Philadelphia-positivo in ricaduta. [2]