Sulforhodamine B sodium salt

Test colorimétrique à la Sulforhodamine B en culture cellulaire pour analyser la prolifération cellulaire
1. Préparez des solutions de traitement avec un volume suffisant pour des triplicats dans des plaques de 96 puits (50 μl par réplicat) ou six réplicats dans des plaques de 384 puits (10 μl par réplicat). Assurez-vous que les volumes tiennent compte des variations de pipetage.
2. Les solutions de traitement peuvent être préparées soit en solution aqueuse (par exemple, Opti-MEM pour les transfections) soit dans un solvant approprié (par exemple, DMSO).
3. Retirez le milieu des monocouches cellulaires et lavez les cellules une fois avec du PBS stérilisé. Ajoutez 1 ml (pour les plaques de 100 mm) de trypsine à 0,25 % pour couvrir uniformément la surface de croissance cellulaire.
4. Incubez à 37 °C pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que les cellules commencent à se dissocier. Inactivez la trypsine avec 10 volumes de milieu de culture contenant du FBS. Mélangez de haut en bas pour obtenir une suspension cellulaire homogène.
5. Transférez la suspension cellulaire dans un tube Falcon stérile.
6. Déterminez la concentration cellulaire à l'aide d'une chambre d'hématocytomètre avec un mélange 1:1 de suspension cellulaire et de solution de bleu trypan à 0,4 %. Facultativement, centrifugez les cellules avant de compter pour laver la trypsine et resuspendez-les dans un milieu de croissance.
7. Ajustez la concentration cellulaire avec un milieu de croissance (10 % de FBS) pour une densité de semis cellulaire appropriée par puits.
8. Mélangez les solutions de traitement et distribuez 50 μl (format 96 puits) ou 10 μl (format 384 puits) dans chaque puits.
9. Mélangez soigneusement la suspension cellulaire et ajoutez 50 μl (format 96 puits) ou 10 μl (format 384 puits) dans chaque puits avec les solutions de traitement.
Remarque: Assurez une distribution cellulaire uniforme au fond du puits, en évitant de secouer pour prévenir les «effets d'anneau».
10. Mettez de côté trois puits pour le contrôle non traité ou le véhicule et trois puits pour la soustraction du fond, puis incubez la plaque à 37 °C avec 5 % de CO2 jusqu'à ce qu'elle soit prête pour la lecture.
11. Ajoutez 25 μl (format 96 puits) ou 5 μl (format 384 puits) de TCA froid à 50 % directement au surnageant du milieu. Incubez les plaques à 4 °C pendant 1 heure sans mélanger.
12. Lavez les plaques quatre fois en les submergeant dans de l'eau du robinet à faible débit et en tapotant l'excès d'eau sur une serviette en papier. Laissez la plaque sécher à l'air à température ambiante.
13. Ajoutez 50 μl (format 96 puits) ou 20 μl (format 384 puits) de solution de SRB à 0,04 % dans chaque puits.
14. Incubez à température ambiante pendant 1 heure et rincez les plaques quatre fois avec de l'acide acétique à 1 % (200 μl pour le format 96 puits ou 30 μl pour le format 384 puits). Laissez la plaque sécher à l'air à température ambiante.
15. Ajoutez 50 μl à 100 μl de solution de base Tris 10 mM (pH 10,5) dans chaque puits et agitez la plaque sur un agitateur orbital pendant 10 minutes pour solubiliser le colorant lié aux protéines.
16. Mesurez l'absorbance à 510 nm dans un lecteur de microplaques.