JIB-04

La JMJD2E aa 1-350 active est purifiée à partir d'E.coli et utilisée in vitro en présence d'α-cétoglutarate, de 5-10 μM de fer, d'acide ascorbique et d'un substrat peptidique d'histone dans une réaction couplée avec la formaldéhyde déshydrogénase supplémentée en NAD+ pour quantifier la production de NADH ou en utilisant le kit Epigentek P-3081. Pour les réactions de déméthylation des histones quantifiées par analyse Western, un construit d'expression His-tagué hJMJ2D aa 1-350, aimablement fourni par les Drs. Y. Shi et J. Whetstine, est exprimé et purifié à partir d'E.coli selon les instructions du manuel Qiagen Ni-NTA agarose et le protocole de Whestine et al 54. En bref, la protéine est éluée dans 50 mM TrisHCl pH 7.8 + 0.3 M NaCl + 10% Glycérol + 200 mM immidazole, et dialysée contre 20 mM TrisHCl pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.2 mM PMSF, 0.5 mM DTT, 8% glycérol. L'enzyme est aliquoteé, congelée rapidement et stockée à -80°C. Pour les tests d'activité par Western blot, ~1.5 μg d'enzyme sont combinés avec 0.3 μg de substrat H3K9me3 (Active Motif #31213) dans 10 μM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 1 mM d'α-cétoglutarate et 2 mM de L-ascorbate de sodium dans 50 mM Hepes pH 7.9 en présence de véhicule ou de médicament et incubés pendant 30 min-2 heures à 37°C. Le tampon de charge SDS est ajouté aux réactions, et après ébullition, les échantillons sont passés sur des gels NuPage 4-12% Bis-Tris, transférés sur nitrocellulose et blottés en utilisant Upstate #07-523 pour détecter H3K9me3. Pour la détection du signal total H3, nous utilisons Active Motif #39763 (primaire) et un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin conjugué à l'IRDye 680 (secondaire, LI-COR # 926-32223) et les blots imagés dans un système d'imagerie infrarouge Odyssey aimablement mis à disposition par le Dr M. Cobb. Pour les déterminations in vitro d'IC50 et les études de compétition, typiquement 100-200 ng de protéine purifiée sont incubés avec le véhicule, JIB-04 ou des analogues, comme indiqué dans les légendes des figures et l'activité mesurée par ELISA (kit Epigentek P-3081 pour la déméthylation H3K9me3, P-3083 pour la déméthylation H3K4me3, et P-3085 pour la déméthylation H3K27me3) dans des réactions contenant 50mM Hepes pH 7.5, 0.01% Tween 20, 120nM (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 1 mM d'α-cétoglutarate, 2 mM de L-ascorbate de sodium et 50ng de substrat peptidique. Les concentrations finales d'enzymes dans les réactions étaient les suivantes : 206 nM JMJD2A, 12 nM JMJD2B, 60 nM JMJD2C, 90 nM JMJD2D E.coli, 30 nM JMJD2D Sf9, 30 nM JMJD2E, 30 nM Jarid1a, 35 nM JMJD3. Les lectures de fond sont données par des enzymes inactivées par la chaleur, 0.5-1 mM 2,4 PDCA ou des réactions sans 2-OG. hJMJD2A (aa1-350) purifié dans E.coli est le don aimable du Dr Jose Rizo-Rey et est dosé à 400 ng/réaction en raison de son activité intrinsèque faible. Le logiciel GraphPad Prism est utilisé pour les calculs d'IC50 et l'ajustement de courbes. E.coli JMJD2D purifiée par nous et Sf9 JMJD2D de BPS ont donné des résultats indiscernables. Notez que pour les tests de compétition de substrat, afin de rester dans la plage linéaire du test et de ne pas saturer la capacité de liaison de la plaque ELISA, les réactions avec > 0.75μM H3K9me3 contiennent un substrat non biotinylé ou sont diluées à l'étape de détection et les signaux ajustés par facteur de dilution. Pour la quantification directe de l'activité H3K9me3 déméthylase dans les lysats cellulaires, les cellules traitées (plaquées à 2 millions/boîte de 10 cm) ou les homogénats tumoraux dans du PBS ont été sonicés (3x 4 sec) et des quantités égales de protéine sont incubées avec un substrat d'histone H3K9me3 dans un tampon de réaction contenant des cofacteurs pendant 2h à 37°C avant une immunodétection spécifique du produit H3K9me2 en utilisant les réactifs du kit Epigentek P-3081. 500 ng de protéine PHD2 purifiée d'E.coli dans 40mM Tris pH 7.4, 100mM NaCl, 20% glycérol, 5mM β-mercapto-éthanol, 10mM maltose sont utilisés pour obtenir une activité dans la plage linéaire. Des peptides biotinylés dérivés de l'ODD de HIF-1 (Biotin-Acp-DLDLEALAPYIPADDDFQL ou Biotin-Acp-DLDLEALAP(OH)YIPADDDFQL comme contrôle hydroxylé) sont immobilisés sur des plaques de 96 puits revêtues de Neutravidine. L'enzyme est incubée dans les puits revêtus dans un tampon de réaction (20 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 0.12 μM de sulfate ferreux, 0.5 mM de 2-oxoglutarate et 1 mM d'ascorbate) pendant 45 min à température ambiante en présence des médicaments indiqués. L'analogue compétitif de l'α-cétoglutarate, le DMOG, est utilisé comme contrôle positif d'inhibition. L'hydroxylation des peptides est détectée en utilisant un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre un épitope peptidique HIF hydroxylé (lapin anti-hydroxyproline 4817, fabriqué en interne), suivi de l'ajout d'un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin conjugué à la HRP. La luminescence est mesurée dans un lecteur de plaques EnVision. L'activité de la protéine recombinante LSD1 est mesurée en utilisant le kit Epigentek P-3075 selon le protocole du fabricant avec l'inhibiteur propriétaire.

Human lung cancer cell lines (LCa), primary or immortalized non-tumorigenic HBECs, prostate cancer (PCa), primary prostate stromal (PrSC) and prostate epithelial cells (PrEC).

~10 μM

96 hours

For cell viability assays, cells are plated at 1500-3000 cells/well in 96 well plates and treated the next day with increasing doses of this compound over 4 days and their viability assessed by standard MTS assays using Promega’s Cell Titer or Cell Titer-Glo reagents according to the manufacturer’s protocols. Absorbance at 490 nm and 650 nm or luminescence is measured by a Spectra Max or a FlouroStar Omega plate reader. Data are normalized to the untreated controls (100% viability). Each cell line is tested in 2-5 independent assays, each containing 4-8 replicates. IC50 values are calculated using DIVISA, a high-throughput software, developed in hous, for storing and analyzing drug sensitivity assays. Dose-response curves are plotted using a non-linear regression model and IC50s are determined from the fitted curves. The average IC50 derived from 2-5 independent assays, each containing 4-8 replicates is reported.

Mice harboring H358 xenografts or A549 xenografts

110 mg/kg (H358, i.p.), 55 mg/kg (A549, Oral gavage)

Oral gavage or i.p.