GSK-J4 Hydrochloride

GSK J4 HCl is an ethyl ester derivative of the JMJD3 selective histone demethylase inhibitor GSK-J1 with an IC50 value greater than 50 μM in vitro. This compound is used to probe the consequences of demethylation of H3K27me3. In human primary macrophages, this chemical inhibits the lipopolysaccharide-induced production of cytokines, including pro-inflammatory tumour necrosis factor (TNF). In addition, it prevents the lipopolysaccharide-induced loss of H3K27me3 associated with the TNF transcription start sites and blocked the recruitment of RNA polymerase II. [1]

GSK-J4 hydrochloride is a potent dual inhibitor of H3K27me3/me2-demethylases JMJD3/KDM6B and UTX/KDM6A. It inhibits LPS-induced TNF-α production in human primary macrophages. This compound is a cell permeable prodrug of GSK-J1.

• AlphaScreen della Histone Demethylase

  L'inibizione delle istona demetilasi viene valutata utilizzando il saggio AlphaScreen dell'istone demetilasi (Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay). Questo saggio utilizza un substrato peptidico biotinilato e si basa sulla rilevazione del marcatore metilico del prodotto utilizzando un anticorpo specifico accoppiato a sfere accettrici di proteina A e una sfera donatrice di Streptavidina per catturare il peptide. In breve, gli enzimi demetilasi ricombinanti vengono incubati in presenza di Fe2+ sotto forma di solfato di ammonio ferroso (FAS), α-chetoglutarato (KG) e substrato peptidico biotinilato. L'acido L-ascorbico è incluso per fornire un ambiente riducente e prevenire l'ossidazione del Fe2+. Dopo l'incubazione con il substrato peptidico, la presenza del prodotto viene rilevata utilizzando la tecnologia AlphaScreen. I saggi AlphaScreen della demetilasi vengono eseguiti in formato di piastra a 384 pozzetti utilizzando proxiplate bianche. Tutti i passaggi vengono eseguiti in tampone di saggio (50 mM HEPES pH 7,5, 0,1% (p/v) BSA e 0,01 % (v/v) Tween-20). Il FAS viene sciolto fresco ogni giorno in 20 mM HCl a una concentrazione di 400 mM e diluito a 1,0 mM in acqua deionizzata. Tutti gli altri componenti vengono sciolti freschi ogni giorno in acqua deionizzata. Per le determinazioni di IC50, 5 μL di tampone di saggio contenente l'enzima demetilasi vengono trasferiti nei pozzetti di una proxiplate a 384 pozzetti. Titolazioni di questo composto (0,1 μL) vengono trasferite in ogni pozzetto e gli enzimi vengono lasciati pre-incubare per 15 minuti con questa sostanza chimica (la concentrazione finale di DMSO è dell'1%). La reazione enzimatica viene avviata con l'aggiunta di 5 μL di una miscela di substrato composta da α-KG, FAS, acido L-ascorbico e substrato peptidico biotinilato e la reazione viene incubata per il tempo indicato a temperatura ambiente. La reazione enzimatica viene arrestata dopo il tempo indicato con l'aggiunta di 5 μL di EDTA (concentrazione finale di 7,5 mM in tampone di saggio). Le sfere donatrici di Streptavidina (0,08 mg/ml) e le sfere accettrici coniugate con Proteina A (0,08 mg/ml) vengono pre-incubate per 1 ora con un anticorpo contro il marcatore metilico del prodotto e la presenza di biotina-H3-prodotto viene rilevata con l'aggiunta di 5 μL delle sfere AlphaScreen pre-incubate (concentrazioni finali di 0,02 mg/ml rispetto alle sfere accettrici e donatrici). La rilevazione viene lasciata procedere per 1 ora a temperatura ambiente e le piastre di saggio vengono lette in un lettore di piastre BMG Labtech Pherastar FS. I dati vengono normalizzati al controllo senza enzima e l'IC50 viene determinata dalla curva di regressione non lineare utilizzando GraphPad Prism 5.

• Linee cellulari

  Mouse podocytes

• Concentrazioni

  5 μM

• Tempo di incubazione

  48 h

• Metodo

  Cells were serum starved for 4 hours, followed by treatment with EPZ-6438 (10 μM) or this compound (5 μM) for 48 hours.

• Modelli animali

  BALB/c mice

• Dosaggi

  10 mg/kg

• Somministrazione

  i.p.